Projeto engenharia genetica e terapia genica Reduccion de la Exprecion de Gluten a Través de la Supresion de Genes por CRISPR/Cas9 y ARNi de γ-gliadinas y ω-gliadinas, en Tritordeum 

Ilenia Nava Zambrano

Resumen 

El trigo es una planta perteneciente a la familia de las Poaceae e al género Triticum. Una planta de distribución y cultivo, a nivel mundial, es uno de los alimentos de mayor importancia y alto consumo en la población, que junto con el maíz y el arroz son los granos más producidos. La harina de trigo es uno de los ingredientes alimentarios más importantes y contiene varios nutrientes esenciales, incluidas las proteínas, como el gluten. El gluten es uno de los principales componentes proteicos del trigo y está formado por glutenina Además de variar según las especies en estudio, la importancia de conocer esta proteína es porque a ella se asocian un conjunto de enfermedades denominadas conjuntamente enfermedades relacionadas con el gluten o (GRDs) por sus siglas en inglés. Las cuales incluyen la enfermedad celiaca asociada a los genes HLA-QD2 y QD8, y las sensibilidades no celiacas. El objetivo de este estudio es la producción de una variedad de trigo que mantenga propiedades parecidas a las del trigo convencionalmente, con una expresión baja gluten a través de la edición y silenciamiento génico. También de la represión de los genes de las γ- y ω-gliadinas localizadas en el brazo corto de los cromosomas 1A, 1B y 1D, por las dos técnicas descritas CRISPR/Cas9 y ARNi en específico miRNA, para la obtención de trigos con un menor impacto toxicos para las personas que presentan sensibilidad del tipo celiaca y no celiaca. La transformación de las semillas del trigo se realizan mediante infecciones con Agrobacterium tumefaciens cargadoras de plásmidos recombinantes, y biobalísticas con las secuencias de miARN. Uno de los retos más grandes encontrados en la modificación de variedades de trigo por métodos de supresión de genes es la dificultad para identificar subunidades de G–BPM y gliadinas (complejo loci Glu–3, Gli–1). 

Plabras clave : edicion genetica, CRISPR/Cas9; gliadinas; recombinantes; celiaca  

Introduccion 

          El trigo es una planta perteneciente a la familia de las Poaceae e al género Triticum, una planta de distribución y cultivo, a nivel mundial es uno de los alimentos de mayor importancia y alto consumo en la población, que junto con el maíz y el arroz son los granos más producidos, para el desarrollo de las plantas de trigo es importante que se mantenga una temperatura y sequía moderada, su teor proteico es alto, y su evolución tecnológica proporciono la definición de tipos conforme su uso más adecuado, 90% del que se produce es el trigo farináceo (Triticum aestivum), 5% se constituye del trigo duro (Triticum durum) cuya utilización se da para a fabricación de pastas y 5% de otros tipos (Triticum compactum y otros). ( Manfron. P rew, 1993)

         La harina de trigo es uno de los ingredientes alimentarios más importantes y contiene varios nutrientes esenciales, incluidas las proteínas. El gluten es uno de los principales componentes proteicos del trigo y está formado por glutenina (codificada en el cromosoma 1) y gliadina (codificada en los cromosomas 1 y 6) y hay alrededor de cien genes que lo codifican en el trigo (Rostami-Nejad, M., 2022). Además de variar según las especies en estudio, la importancia de conocer esta proteína es porque a ella se asocian un conjunto de enfermedades denominadas conjuntamente enfermedades relacionadas con el gluten o (GRDs) por sus siglas en inglés.

           Las cuales incluyen la enfermedad celiaca es una enfermedad global que se ha informado en Europa occidental y oriental, América del Norte, América del Sur, Asia, Oceanía y África, En una revisión sistemática y un metanálisis, se estimó que la seroprevalencia global y la prevalencia confirmada por biopsia de la ECe eran del 1,4% y el 0,7%, respectivamente. La seroprevalencia de CeD en los EE. UU. según las Encuestas Nacionales de Examen de Salud y Nutrición (NHANES) fue del 0,7% y, de acuerdo con una variedad de estudios de población de todo el mundo, mostró que la mayoría de los casos permanecen sin diagnosticar en la comunidad (Tye-Din J., 2018).

             Es una enfermedad autoinmune, las personas prepuestas presentan los alelos de los genes HLA-QD2 y HLA-QD8, aun así llevar los genes no implica el desarrollo de la enfermedad, la detección de la enfermedad se realiza a través de biopsias tomadas del intestino donde se demuestren vellosidades atrofiadas, hiperplasia de las crestas, presencia de anticuerpos circundantes específicos, contra la transglutaminasa tisular (tTG), los péptidos de gliadina desamidados (DGP) y el endomisio (Tye-Din J., 2018).

             Además de las complicaciones comunes de la enfermedad, se han realizados estudios que la asocian a otras enfermedades autoinmunes como la diabetes Tipo 1 y el hipertiroidismo, y también se asocia a cáncer en el intestino. 

               Sensibilidad al gluten no celiaca: es una sensibilidad que aún no ha sido 100% dilucidada, la primera persona en hablar sobre esta sensibilidad fue ellis and linkarde en 1978, y estudios recientes han demostrado que los FODMAPs (oligosacáridos, monosacáridos, disacáridos y polioles fermentables) y algunas NGP del trigo, como los ATIs, parecen activar el sistema inmunitario innato y, por lo tanto, desempeñan cierto papel en la sensibilidad No-celiaca según (Leon, S. 2020). 

          En la actualidad no existe ningún tipo de tratamiento para la enfermedad celiaca y las sensibilidades no celiacas, por lo que la única opción recomendable es una dieta libre de gluten de por vida, algunos estudios realizados recientemente, han demostrado que las personas con sensibilidad no celiaca pueden llegar a tener una tolerancia (que difiere para cada persona), al gluten. El aumento creciente de los diagnósticos de estas enfermedades causan un gran impacto económico en las empresas alimenticias y de bebidas que contienen gluten como el pan, la cerveza, alimentos que contiene (cebada, y centeno), también como el aumento en la demanda de alimentos libres de gluten.

                   El desarrollo de cereales desprovistos de epítopos inmunogénicos es una posibilidad muy atractiva. Desafortunadamente este objetivo es casi imposible de alcanzar mediante mejora genética vegetal clásica, debido al alto número de copias de los genes que codifican para las proteínas del gluten y su elevada complejidad. (Leon, S. 2020). Por lo que las estrategias que se abordan para este tipo de mejoramiento no son las herramientas clasicas del mejoramiento vegetal, si no que se abordan tecnicas biotecnologicas mas modernas, tambien la posibilidad de usar variedades de trigo que carecen del gen D, el cual fue denominado tritodeum.

                   Las tecnicas que se han estado intentando abordar para superar las compliaciones que se han presentado son CRISPR/Cas9, y los ARNi con regiones especificas de silenciamiento en secuencias especificas para los ARNm de las gliadinas, segun (Pradanos V., 2012) Los resultados obtenidos muestran que la eliminación de α/βgliadina disminuye la presencia de epítopos que estimulan células T, pero también afecta negativamente a las propiedades tecnológicas de la harina. Sin embargo, la reducción de los niveles de γ-gliadina y ω-gliadina/LMW-glutenina mantiene estas propiedades a la vez que reduce la presencia de epítopos. 

                       CRISPR este sistema fue descrito en 1987 por el investigador de la Universidad de Osaka Yoshizumi Ishino, como parte del sistema de defensa en bacterias, este sistema traba junto con la enzima endonucleasa Cas9, su funcionamiento fue descrito más tarde por francisco mujica en España, donde demostro que CRISPR es usa para el clivaje del ADN exogeno, la cual es guiada por una secuencia de RNA que se parea con el ADN alvo, CRISPR está constituida por sistema palíndromico cortas con secuencias de separación, estos espacios pueden de separación son ocupados por secuencias de los bacteriófagos que más tarde son usados para el reconocimiento y fabricación de un ARN guía que será utilizado para la degradación de AND exógeno de secuencia similar a la del fago con el que estuvo en contacto anteriormente. A partir de estos, CRISPR se volvió una herramienta de interés en la edición de genes, no solo bacteriano, sino que se comenzó a usar para la edición de genes de secuencia conocida, induciendo la ligación con CRISPR para luego obtener el ADN guía para Cas9, y así eliminar, modificar, mutar, o silencia la secuencia del gen alvo.

                       Según (Noriega, D. 2016), el ARN de interferencia (ARNi), es una molécula de ARN de doble cadena, utilizada para suprimir la expresión de genes ampliamente distribuidos en eucariotas, existen diferentes tipos de ARNi, algunos de ellos son miRNA, siRNA que presentan un efecto de ribointerferencia impidiendo la traducción de ARNm a proteínas, estos mecanismos pueden estar presentes de manera endógena en las plantas, la secuencia de ARNi es complementar idéntica o prácticamente idéntica a la secuencia de genética alvo, induciendo el corte directamente a través del complejo RISC, actuando como protector contra patógenos, y transposones. El ARNi se considera una herramienta biotecnológica eficaz para silenciar la expresión de genes de microorganismos fitopatógenos (Gamero, M. 2023). En animales este proceso es más complejo y divergente en el silenciamiento del ARNm alvo. 

                          Materiales y Metodologia 

 Termociclador 

 incubadoras, 

 autoclaves 

 pipetas 

 Electroporador 

 Cartuchos de biolística

  Microproyectiles (generalmente de oro o tungsteno) recubiertos con el miARN. 

 Dispositivo de biolística 

 Tubos de recolección para las semillas bombardeada

  materiales para PCR 

 Secuencia CRISPR

  Enzima Cas9

  Plasmido 

 Tritordeum

  miARNs

  Promotor

  fragmentos de las secuencias de los genes alvo de γ-gliadina y ωgliadina/LMW-glutenina  

        Metodos 

        Inicialmente, la variedad escogida de trigo para la investigación es un cereal derivado del cruce entre una especie de cebada silvestre y un trigo duro del género Tritordeum, ya que a diferencia de otros trigos, este posee únicamente los cromosomas AABB, perdida de los DD por hibridación, por lo que ya presenta una baja expresión de la γgliadina y ω-gliadina, los genes que codifican para estas proteínas pertenecen a los locus Glu-3 y Glu-1 localizados en los cromosomas 1A y 1B.

          La purificación del ADN se realiza por protocolos documentados en (Zerene, M.,2000), y que fue descrito por Saghai-Maroof et al. (1984).

            La secuencias de los microsatélites se obtuvieron a través de la descripción de los mismos en Zerene M. 2000, los cuales serán usados para la síntesis de las secuencias de miRNAs en la técnica de silenciamiento, y las secuencias ARNg para el método de CRISPR/Cas9 

locus de γ -gliadina:

 F1: 5’ - GCA GAC CTG TGT CAT TGG TC -3’ (20-mer) 

R1: 5’ - GAT ATA GTG GCA GCA GGA TAC G -3’ (22-mer) 

locus de ω-gliadina o glutenina de bajo peso molecular (LMWG):

 P1: 5’ - TCC CGC CAT GAG TCA ATC -3’ (21-mer)

 P2: 5’ - TTG GGA GAC ACA TTG GCC -3’ (21-mer)

                    Estas secuencias son amplificadas por tecnica de PCR, los reactivos usados en la tecnica de PCR -Taq DNA polimerase (thermo-stable DNA polimerase), - [ ] de Mg2+ e dNTPs), pode favorecer a interrupção da polimerização, -1-2,5 U/reação de 50 , Em geral são fornecidas conjuntamente com solução-tampão (composição pode varia com o fabricante) e Inibidores da enzima Taq: fenol, Proteinase K, Agentes quelantes em excesso, (EDTA), SDS, elevadas concentrações de sal, primers.

                    Protocolo básico

                 DNA molde 10 - 100 ng, dNTPs 200 μM, Primers (cada) 1 – 10 μM, Tampão 50 mM, MgCl2 2,5 mM, Taq DNA polimerase 1 – 2,5 U.

              Después de una denaturación inicial a 94ºC por 5 min, las muestras fueron amplificadas de acuerdo al siguiente perfil térmico: 30 ciclos de un minuto a 94ºC (denaturación), un minuto de unión de partidores a 55ºC (partidores F1/R1) o 60ºC (partidores P1/P2), y 2 min de extensión a 72ºC.

                 Fabricacion de plasmidos para la introduccion de la secuencia genetica de la enzima Cas9 extraida de Streptococcus pyogenes, y amplificada por PCR, el plamido debe estar provisto de un promotor, la secuencia de ARNg 

5’ - TCC CGC CAT GAG TCA ATC -3 ADN 

5’ – AGG GCG GUA CUC AGU UAG 3’ ARNg

                      Una secuencia marcadora de restincia a antibiotico para diferenciar, y aislar a las celulas que portaran el plasmido. 

                       Inicialmente se digiere el plasmido con enzimas de restriccion endonucleasa en los sitios de interes compatibles con la secuencia del gen codificante para Cas9, ARNg y se juntan con los componentes, que son ligados por una enzima ligasa que compondran el plamido recombinante de interes. 

                La amplificacion y maxificacion de los plasmidos es un proceso realizado en bacterias Agrobacterium tumefaciens las cuales deben ser competentes, los plamisdos se introducen por electroporacion y se ponen a crecer en medio de cultivo por un tiempo de 24horas o hasta que alcance la densidad optica adecuada de 0.6 a 0.8 a 600nm, luego se realiza una caracterizacion por medios electroforeticos.

                       Infeccion de las semillas de tritordeum 

                 Se mezclan las semillas del trigo de mejor calidad y libre de patogenos con la suspencion de A. tumefaciens, incubandolas a una temperatura 20-25 grados temperatura en la que la bacteria tiene una mejor eficiencia de crecimiento, y a una humedad del 80%. 

             Las semillas infectadas se dejan crecer en un medio de cultivo con todos los nutrientes necesarios junto con un antibiotico de seleccion.

ω-gliadina o glutenina de bajo peso molecular (LMWG), por ARNi identificar las secuencias de ADN que se quieren suprimir 

P1: 5’ - TCC CGC CAT GAG TCA ATC -3’ 

P2: 5’ - TTG GGA GAC ACA TTG GCC -3 

ARNm Alvo

 P1: AGG GCG GUA CUC AGU UAG

 P2: AAC CCU CUG UGU AAC CGG 

miARN complementar 

P1: UCC CGC CAU GAG UCA AUC 

P2: UUG GGA GAC ACA UUG GCC

 Luego se amplifican las secuencias de miARN por la tecnica de PCR. 

Finalmente la introduccion de los miARN se realiza por biobalistica 

Preparación de semillas:

 Las semillas de tritordeum deben estar limpias, libres de patogenos y secas antes de comenzar el proceso.

             Se procede a recubrir los microproyectiles con el miARN con oro o tungsteno y se recúbren con el miARN de ω-gliadina. Esto se logra aplicando una solución de miARN a las partículas de microproyectiles y dejando que se sequen. Carga los microproyectiles recubiertos con el miARN en los cartuchos de biolística. Usando una cantidad específica de microproyectiles para cada disparo. Las semillas se colocaran en un soporte adecuado (como una placa de Petri) para facilitar la exposición a los microproyectiles. Fase de bombardeo el soporte con las semillas se coloca en la cámara de bombardeo, se disparan los cartuchos cargados con microproyectiles recubiertos con miARN hacia las semillas.

              Los microproyectiles penetrarán en las células de las semillas, liberando el miARN en el interior de las células. Después del bombardeo, se recoge las semillas bombardeadas y colócalas en un medio de cultivo adecuado para su germinación y crecimiento. Este medio debe proporcionar los nutrientes necesarios para el desarrollo de las plántulas, como lo es el medio de cultivo Medio MS (Murashige y Skoog).

                   Consideraciones finales 

               Las γ- y ω-gliadinas contienen los epítopos principales y clínicamente más relevantes. También se denominan epítopos inmunodominantes, ya que la mayoría de los pacientes con EC que expresan HLA-DQ2. responden a los epítopos, DQ2.5-glia-ω1 y DQ2.5- glia-ω2 (Jouanin, A, 2020), el objetivo de la represion de los genes de las γ- y ωgliadinas por las dos tecnicas descritas CRISPR/Cas9 y ARNi en especifico miRNA, para la obtencion de trigos con un menor impacto toxicos para las personas que presentan sensibilidad del tipo celiaca y no celiaca, segun Rodigo L., 2013, estas líneas podrían servir de base para tratar otras patologías relacionadas con el gluten como son la anafilaxis dependiente de ejercicio físico y la sensibilidad al gluten.

                 En algunos estudios se domostro que las gliadias del tipo γ- y ω pueden ser suprimidos sin causar grandes alteraciones en las propiedades elasticas del trigo, con tritordeum sugiere que este nuevo cereal podría ser tolerado al menos por un subconjunto de pacientes con NCGS que no requieren la exclusión estricta del gluten y que así podrían beneficiarse de sus mejores propiedades organolépticas y nutricionales. Por lo que la edicion de los genes es esta especie podria aumentar el rango de personas que puedan consumirlo.

                   La tecnica CRISPR/Cas9 no es 100% especifica por lo que se deben realizar las pruebas de comprovacion para saber si la tecnica se realizo de manera efectiva, y realizar todos los protocologor de etica y bioseguridad pruebas de laboratorio en cultivos de tejidos que permitan evaluar las caractericas y reacciones de los tejidos en presencia de los granos de trigo modificados.

                   Limitaciones encontradas en la edicion de genes 

             Uno de los retos mas grandes encontrados en la modificacion de variedades de trigo por metodos de supresion de genes es la difícultad para identificar subunidades de G–BPM y gliadinas (complejo loci Glu–3 y Gli–1) en geles de poliacrilamida, en presencia de dodecil sulfato de sodio, debido a la cantidad de genes (35 a 40) que conforman el loci Glu–3 hay ligamiento genético entre las G–BPM (locus Glu–3) y (ω–gliadinas (locus Gli–1), localizadas en el brazo corto de los cromosomas 1A, 1B y 1D.

                  Cronograma 

Actividad                                                                tiempo

Escoger semillas de calidad                                    1 semana  

Adecuacion de las semillas                                       2 semanas 

Purificacion de las secuencia y pruebas de pureza    3 semanas 

Fabricacion de plasmidos recombinantes                   2 semanas 

Amplificacion de los plasmidos en A. tumefaciens,     3 semanas 

Seleccion de colonias recombinantes                           2 semanas

 Pruebas de verificacion de plasmidios recombinantes  1 semana

 Infeccion de las semillas                                              1 semana

 Crescimiento de las plantulas recombinantes               12 semanas

Referencias bibliograficas 

CORSO, M. OLIVAES, J. MADEIROS, M. O Sistema CRISPR/Cas9 e a Possibilidade de Edição Genômica para a Cardiologia, janeiro 2017 

GAMERO, M. TOLOZA, D. BELAICH, M. BARRERA, G. ARN de interferencia (ARNi): una herramienta eficaz en agrobiotecnología. Rev. colomb. biotecnol vol.24 no.2 Bogotá July/Dec. 2022 Epub Mar 07, 2023 

JOUANIN, A. GILISSEN, L. SCHAART, J. LEIGH, F.COCKRAM, J. WALLINGTON, E. BOYD, L. BROECK, H. VAN DER MEER, I. AMERICA, A. VISSER, R. SMULDERS M.; CRISPR/Cas9 Gene Editing of Gluten in Wheat to Reduce Gluten Content and Exposure Reviewing Methods to Screen for Coeliac Safety REVIEW article. Front. Nutr., 24 April 2020 Sec. Nutritional Immunology Volume 7 - 2020 | https://doi.org/10.3389/fnut.2020.00051 

LEON S. Identificación y desarrollo de cereales aptos para personas con alergias e intolerancia al gluten, españa, 2020 

MANFRON. P, LAZZAROTTO. C, PETTER, S. TRIGO - Aspectos agrometeorológicos, Santa Maria, Brasil, Revisão Bibliográfica • Cienc. Rural 23 (2) • Ago 1993 

• NORIEGA D. VALENCIA A. VILLEGAS B. ARN de interferencia (ARNi): una tecnología novedosa con potencial para el control de insectos plaga, Rev. U.D.C.A. Act & Div. Cient. 19(1): 25-35, Enero-Junio, 2016 

RODRIGO, L. SALVADOR, A. Enfermedad celíaca y sensibilidadal gluten no celíaca 2013. DOI: http://dx.doi.org/10.3926/oms.16

 ROSTAMI-NEJAD, M. ANDERSSON P., ROSTAMI, K. The Gluten Gene: Unlocking the Understanding of Gluten Sensitivity and Intolerance, Pages 37-50 Published online: 17 Nov 2022. https://doi.org/10.2147/TACG.S276596 

TYE-DIN, J. GALIPEAU H., AGARDH D. Celiac Disease: A Review of Current Concepts in Pathogenesis, Prevention, and Novel Therapies REVIEW article Front. Pediatr., 21 November 2018. Volume 6 - 2018 | https://doi.org/10.3389/fped.2018.00350

 ZERENE, M. GRANGER, D. PRENH, D. HINRICHSENT, G. secuencias de microsatélites asociadas a genes de proteínas de reserva en variedades chilenas de trigo harinero: descripción y posible uso como marcadores de calidad panadera. Agric. Téc. v.60 n.1 Chillán ene. 2000, http://dx.doi.org/10.4067/S0365-28072000000100002